Cut&Tag ChIP-seq MeRIP-seq(微量/极微量) eccDNA-seq ATAC-seq |
Cut&Tag-Seq
Ι 背景介绍
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）是一种研究蛋白质与DNA互作的新方法。该方法通过分子生物学手段将高活性的Tn5转座酶与Protein A融合，并装载建库接头引物形成pA-Tn5转座复合物。在抗体的引导下该pA-Tn5转座复合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。与传统ChIP-Seq相比，该技术无需交联与超声打断操作，规避了其所引起的抗原决定簇遮盖和样本损失问题，提高了信噪比，并使所需细胞量减少（可低至60个）。与CUT&Run相比，该技术在pA-Tn5转座复合物进行切割时在切割片段的两端加上接头序列，可直接PCR建库，无需末端抹平和接头连接的操作，省时高效。
CUT&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端，应用于临床和科研的表观遗传学研究。或是结合生物信息学分析，找到转录因子下游调控的靶基因，为进一步阐明生物学机制提供依据.
Ⅱ 样本要求
类型 | 细胞送样要求 | 组织送样要求 | 备注 |
组蛋白修饰 | 冻存前细胞活率≥90%，并且复苏后细胞活率≥85%，每个细胞样本准备2份。 每份冻存的细胞量≥50万个（包括特异性抗体IP的细胞量和IgG阴性对照的细胞量 | 要求每个样本准备2份，每份≥100mg，单独分装（不费劲，真的）。 100mg为建议量，一次实验的标准量是20万个细胞核，包括特异性抗体IP的量和IgG阴性对照的量 | 单独分装于冻存管中（请老师自行分装成2份，避免分样过程造成样本损失或降解，一份为实验样本，一份为备份样本。 |
转录因子 | 要求冻存前细胞活率≥90%，并且复苏后细胞活率≥85%，每个细胞样本准备2份（保存于1.5mL/2mLEP管中），每份冻存的细胞量≥50万。 包括特异性抗体IP的细胞量和IgG阴性对照的细胞量。 若单份细胞量≥100万，我给您点个赞，成功率也给您点个赞！ | 要求每个样本准备2份，每份≥200mg。 单独分装（你知道我要说什么） 200mg为建议量，一次实验的标准量是100万个细胞核，包括特异性抗体IP的量和IgG阴性对照的量。 |
Ⅱ 样本准备说明
| 样本类型 | 操作方式 | 运输方式 |
| 新鲜细胞 | 1、将样本制备成悬浮细胞，贴壁细胞需先消化好 2、细胞用培养基悬浮，装满离心管，防止运输过程中晃动，管盖用封口膜封住，标记好样本信息。外层可包装气泡膜或装入50mL离心管中，塞满缓冲物固定。 3、再好好地看一遍1和2 | 普通冰袋、蓝冰或者常温运输（4-10月不推荐），具体条件由细胞类型决定，4 小时内寄送到实验室。 |
| 组织样本 | Fisrt of ALL!!!为防止样本降解，样本处理过程应在冰上快速进行。 1、若活体取样，请尽量剔除结缔组织以及其它非目标组织 2、用预冷的PBS漂洗，去除血液和杂质，需使用不含Mg2+和Ca2+的PBS（即DPBS），Mg2+和Ca2+会影响Tn5酶的效率； 3、体积较大的组织需切割成绿豆大的小块； 4、将样本装入事先做好标记的冻存管中（管子速冻后无法做标记），立即液氮速冻2 min或者，-80℃保存。如没有液氮，也可以立即在干冰上放置15 min， -80℃保存 | 干冰运输 |
| DNA文库 | 1、总体积≥25ul，浓度≥2ng/ul，总量≥50ng 2、请详细提供P7端和P5 index序列，测序策略为illumina NovaSeq 6000，PE150 3、请使用1.5ml离心管，请确保质量好（管壁越厚越好）——婉拒PCR管 4、若混文库，请您自己动手，丰衣足食。以此避免若出现产出问题，双方矛盾焦点聚焦于混样操作。故，我们婉拒您可能需要的混样服务，但还是要提醒，一定建库时看到index。 | 干冰/冰袋运输 |
注：微量样本/特殊样本请先与销售经理沟通清晰后，再行决定。
Ⅲ 避坑指南
（1）The better the sample, the better the result；The worse the sample, the worse the result
（2）若同时想做WB ：额外提供一管2million细胞/50mg组织作为WB样本，检测抗体的特异性和蛋白表达量。
（3）如需混样，请混合好后再寄送，避免混样过程中造成样本损失或降解，引起双方误解。
（4）抗体指南：一抗避免与送测样品物种一样。如，送样物种为小鼠，一抗不要选鼠抗，可以选择兔抗或者羊抗；同理，送样物种为兔，一抗不要选兔抗，可选择鼠抗或者羊抗。——避免数据污染问题
（5）可提供抗体：H3K27ac（abcam ab4729 ）、H3K4me3（abcam，ab8580）、H3K9ac（abcam，ab4441）、H3K27me3（abcam，ab6002）、GFP抗体 (ab290 )
（6）您自己提供抗体：请详细说明抗体信息和寄送方式（务必提供下列信息：鼠抗/兔抗/X抗、稀释倍数、是否自制抗体、商用抗体的货号、是随样本寄送还是单独寄送）
Ⅳ CUT&Tag实验流程示意图
细胞先与包被刀豆蛋白A的磁珠（Concanavalin A-coated magnetic beads, ConA beads）吸附结合，方便后续操作。用非离子去污剂洋地黄皂苷（Digitonin）进行细胞穿孔后，依次孵育针对靶蛋白的一抗、相应的二抗、pA-Tn5融合蛋白。其中pA-Tn5中的pA可以识别二抗的Fc区域，Tn5酶在加入Mg2+后定向切割靶蛋白附近的DNA序列。且Tn5酶进行切割时会在切割片段的两端加上接头序列，因此切割产物可以直接PCR扩增建库，经纯化后用于高通量测序。
V 部分结果展示
LncRNA-seq
Ι 背景介绍
长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是长度200-100000 nt的非编码 RNA。研究表明，LncRNA 在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能，极大地解释了基因组复杂性，为研究者从基因表达调控网络的维度来认识生命体的复杂性打开新思路。
Ⅱ 样本准备
物种 | 总RNA送样要求 | 送组织样量要求 | 备注 |
动物组织 | 体积≥20ul,浓度≥100ng/ul 总量≥1ug。 琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解 去除gDNA； 避免紫外和强酸碱环境 不可反复冻融 装载于1.5mLEP管中。 | 组织鲜重≥300mg | 手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存 |
细胞 | 细胞总数≥1x107 | 生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每1×107细胞（2板10 cm2培养面积）加入2 ml TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于5mL冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞 | |
抗凝全血 | 抗凝全血≥5mL (不包括trizol体积) | ▶离心分离得到白细胞或者有核细胞，加TRIzol 处理，液氮速冻干冰运输 ▶冻存管中加入15 ml TRIzol和5 ml 新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80°C冻存。 | |
PAXgene采血管 | ≥3-5管 | 送样前一定备注是PAXgene 法获取，提取方式不同 | |
植物组织 | 幼嫩叶片根茎等组合桌子鲜重≥500mg；花、果实、种子鲜重≥1.0g | 将新鲜取下的样本，清洗掉杂质，切成小块并置于1.5mL冻存管中，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 |
注：石蜡样本、血清血浆、细菌、真菌类样本不接收。
Ⅲ 避坑指南
（1） Thebetter the sample, the better the result
（2） Theworse the sample, the worse the result
（3） 同组内，保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）
否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysispossible with only 1/2 biological replications?
（4） LncRNA具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。
（5） 有公司称LncRNA测序为全转录组测序？Bullshit！smallRNA呢？
（6） LncRNA能做的是LncRNA+mRNA测序，并在由于其第一步去除rRNA的建库方式，可获取部分（10-20%）的circRNA信息
Ⅳ 项目流程
V 一图读懂LncRNA体内作用机制
1、编码基因5’端上游启动子区（橙色）发生转录，干扰下游基因（蓝色）的表达；
2、抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因（蓝色）的表达
3、与编码基因的转录本形成互补双链（紫色），干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式
4、与编码蛋白基因的转录本形成互补双链（紫色），在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；
5、与特定蛋白质结合，LncRNA转录本（绿色）可调节相应蛋白的活性；
6、作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；
7、结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；
8、作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子
VI 部分结果展示
内容较多，请联系销售员或客服获取
小RNA测序（SmallRNA-seq）
Ι 背景介绍
Small RNA是一大类调控ncRNA，基因长度在18-35nt（植物18-30nt），几乎存在于所有的生物体中。
Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。
Small RNA通过mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成、DNA去除等多种多样的作用途径，调控生物体的生长发育和疾病发生。
Small RNA测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。
Ⅱ 样本准备
物种 | 总RNA送样要求 | 送组织样量要求 | 备注 |
动物组织 | 体积≥20ul，浓度≥100ng/ul ，总量≥2.0ug 琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解 去除gDNA 避免紫外和强酸碱环境 不可反复冻融 装载于1.5mLEP管中。 | 组织鲜重≥300mg | 手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存 |
细胞 | 细胞总数≥1x107 | 生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每1×107细胞（2板10 cm2培养面积）加入2 ml TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于5mL冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞 | |
抗凝全血 | 抗凝全血≥5mL (不包括trizol体积) | ▶离心分离得到白细胞或者有核细胞，加TRIzol处理，液氮速冻干冰运输 ▶冻存管中加入15 ml TRIzol和5 ml 新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80°C冻存。 | |
PAXgene采血管 | ≥3-5管 | 送样前一定备注是PAXgene法获取，提取方式不同 | |
植物组织 | 幼嫩叶片根茎等组合桌子鲜重≥500mg；花、果实、种子鲜重≥1.0g | 将新鲜取下的样本，清洗掉杂质，切成小块并置于1.5mL冻存管中，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 |
注：本公司暂时不接真菌、精浆、海洋生物、水果果实
Ⅲ 避坑指南
（1）The better the sample, the better the result
（2）The worse the sample, the worse the result
（3）同组内，保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）
否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysis possible with only 1/2 biological replications?
（4）SmallRNA具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。
（5）miRNA片段很短，降解组织，石蜡组织的rRNA、mRNA等等均出现大量降解，在smallRNA建库过程中，试剂盒不区分片段类型，
长度类似的序列均会建库，故降解样本会严重挤占miRNA测序数据，要么不做，要么加测数据量。
Ⅳ 项目流程
V 部分结果展示
CircRNA-seq
Ι 背景介绍
环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。
在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。
Ⅱ 样本准备
物种 | 总RNA送样要求 | 送组织样量要求 | 备注 |
动物组织 | 体积≥20ul,浓度≥150ng/ul，总量≥3ug
琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解
无gDNA、蛋白等杂质污染 无颜色异常
避免紫外和强酸碱环境，不可反复冻融，装载于1.5mLEP管中。 | 组织鲜重≥800mg | 手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存 |
细胞 | 细胞总数≥1x108 | 生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每1×108细胞加入足量TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞 | |
抗凝全血 | 抗凝全血≥8mL (不包括trizol体积) | ▶离心分离得到白细胞或者有核细胞，加TRIzol 处理，液氮速冻干冰运输 ▶冻存管中加入TRIzol和新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80°C冻存。 | |
PAXgene采血管 | ≥5管 | 送样前一定备注是PAXgene 法获取，提取方式不同 |
Ⅲ 避坑指南
（1） Thebetter the sample, the better the result
（2） Theworse the sample, the worse the result
（3） 同组内，保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysispossible with only 1/2 biological replications?
（4） CircRNA具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。
（5） LncRNA能做的是LncRNA+mRNA测序，并在由于其第一步去除rRNA的建库方式，可获取部分（10-20%）的circRNA信息。通过这种方式获取的circRNA，circRNA是可信结果，但可能从宏观看，丢失了很多circRNA关键信息。
（6） 建议同一份样本做smallRNA+mRNA或者全转录组，获取更多的互作信息。
Ⅳ 项目流程
V 环状RNA有哪些生物功能
▶CircRNA顺式调控亲本基因的表达
一方面，circRNA可以与RNA结合蛋白相互结合影响亲本基因mRNA的表达。另一方面，环状RNA形成过程中内含子间竞争性互补配对可以与线性RNA之间达成一种平衡，影响mRNA的表达，其至蛋白翻译。
▶ceRNA竞争机制——circRNA海绵吸附microRNA
Nature杂志上发文报道，CDR1基因起源的环状RNA(ciRS-7)可以结合吸附miR-7，从而降低miR-7的活性，间接上调miR-7相关靶mRNA基因的表达。由于环状 RNA的稳定性，在机体内潜在对microRNA的吸附能力要强于线性的mRNA和IncRNA，所以在整体调控网络中，circRNA的竞争机制是非常特别的一种调控方式。
▶作为疾病的生物标注物?
众所周知，RNA表达具有组织特异性，环状RNA亦然。研究发现has circ 002059在冒癌中表达下调，是一个潜在的胃癌诊断的biomarker。某专家团队对肝癌细胞外泌体circRNA测序发现，circRNA在外泌体中大量富集目于正常细胞相比差异很大，同时血清中肿瘤circRNAs的富集程度甚至与肿瘤的大小有关。
VI CircRNA研究思路
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