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真核生物mRNA-seq

LncRNA-seq

SmallRNA-seq

circRNA-seq

全转录组测序

原核转录组

转录常用作图工具

转录组测序（mRNA-seq）

Ι 背景介绍

转录组测序通常指mRNA测序，即通过高通量测序法获取细胞或组织器官在某一时空状态正在发生转录的mRNA总和。

也就是目前常规的RNA-seq技术。随着单细胞转录组测序技术不断发展，常规RNA-seq又称为Bulks RNA-seq。

Ⅱ 样本准备

物种	总RNA送样要求	送组织样量要求	备注
动物组织	体积≥20ul,浓度≥30ng/ul。琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解，去除gDNA；避免紫外和强酸碱环境，不可反复冻融，装载于1.5mLEP管中。	组织鲜重≥300mg	手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存
细胞		细胞总数≥5x10⁶	生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每5×106细胞（10 cm2培养面积）加入1 ml TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于1.5mL冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞
抗凝全血		抗凝全血≥3-5mL	方法①离心分离得到白细胞或者有核细胞，加 TRIzol 处理，液氮速冻干冰运输方法②冻存管中加入6 ml TRIzol和 2 ml 新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80 °C冻存。
PAXgene采血管		≥2管	送样前一定备注是PAXgene 法获取，提取方式不同
植物组织		幼嫩叶片根茎等组合桌子鲜重≥300mg；花、果实、种子鲜重≥500mg	将新鲜取下的样本，清洗掉杂质，切成小块并置于1.5mL冻存管中，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。

注：微量样本请参考我公司微量单细胞转录组测序内容；石蜡样本不接

Ⅲ 避坑指南

（1）The better the sample, the better the result；The worse the sample, the worse the result

（2）同组内保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）

否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysis possible with only 1/2 biological replications?

（3）RNA-seq具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。

（4）石蜡切片样本做RNA-seq基本质量不会合格，尽量和病理沟通保存新鲜组织。

Ⅳ 项目流程

V 部分结果展示

LncRNA-seq

Ι 背景介绍

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是长度200-100000 nt的非编码 RNA。研究表明，LncRNA 在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能，极大地解释了基因组复杂性，为研究者从基因表达调控网络的维度来认识生命体的复杂性打开新思路。

Ⅱ 样本准备

物种	总RNA送样要求	送组织样量要求	备注
动物组织	体积≥20ul,浓度≥100ng/ul 总量≥1ug。琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解去除gDNA；避免紫外和强酸碱环境不可反复冻融装载于1.5mLEP管中。	组织鲜重≥300mg	手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存
细胞		细胞总数≥1x10⁷	生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每1×10⁷细胞（2板10 cm²培养面积）加入2 ml TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于5mL冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞
抗凝全血		抗凝全血≥5mL (不包括trizol体积)	▶离心分离得到白细胞或者有核细胞，加TRIzol 处理，液氮速冻干冰运输 ▶冻存管中加入15 ml TRIzol和5 ml 新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80°C冻存。
PAXgene采血管		≥3-5管	送样前一定备注是PAXgene 法获取，提取方式不同
植物组织		幼嫩叶片根茎等组合桌子鲜重≥500mg；花、果实、种子鲜重≥1.0g	将新鲜取下的样本，清洗掉杂质，切成小块并置于1.5mL冻存管中，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。

注：石蜡样本、血清血浆、细菌、真菌类样本不接收。

Ⅲ 避坑指南

（1） Thebetter the sample, the better the result

（2） Theworse the sample, the worse the result

（3）同组内，保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）

否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysispossible with only 1/2 biological replications?

（4） LncRNA具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。

（5）有公司称LncRNA测序为全转录组测序？Bullshit！smallRNA呢？

（6） LncRNA能做的是LncRNA+mRNA测序，并在由于其第一步去除rRNA的建库方式，可获取部分（10-20%）的circRNA信息

Ⅳ 项目流程

V 一图读懂LncRNA体内作用机制

1、编码基因5’端上游启动子区（橙色）发生转录，干扰下游基因（蓝色）的表达；

2、抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因（蓝色）的表达

3、与编码基因的转录本形成互补双链（紫色），干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式

4、与编码蛋白基因的转录本形成互补双链（紫色），在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；

5、与特定蛋白质结合，LncRNA转录本（绿色）可调节相应蛋白的活性；

6、作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；

7、结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；

8、作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子

VI 部分结果展示

内容较多，请联系销售员或客服获取

小RNA测序（SmallRNA-seq）

Ι 背景介绍

Small RNA是一大类调控ncRNA，基因长度在18-35nt（植物18-30nt），几乎存在于所有的生物体中。

Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。

Small RNA通过mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成、DNA去除等多种多样的作用途径，调控生物体的生长发育和疾病发生。

Small RNA测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。

Ⅱ 样本准备

物种	总RNA送样要求	送组织样量要求	备注
动物组织	体积≥20ul，浓度≥100ng/ul ，总量≥2.0ug 琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解去除gDNA 避免紫外和强酸碱环境不可反复冻融装载于1.5mLEP管中。	组织鲜重≥300mg	手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存
细胞		细胞总数≥1x10⁷	生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每1×10⁷细胞（2板10 cm²培养面积）加入2 ml TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于5mL冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞
抗凝全血		抗凝全血≥5mL (不包括trizol体积)	▶离心分离得到白细胞或者有核细胞，加TRIzol处理，液氮速冻干冰运输 ▶冻存管中加入15 ml TRIzol和5 ml 新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80°C冻存。
PAXgene采血管		≥3-5管	送样前一定备注是PAXgene法获取，提取方式不同
植物组织		幼嫩叶片根茎等组合桌子鲜重≥500mg；花、果实、种子鲜重≥1.0g	将新鲜取下的样本，清洗掉杂质，切成小块并置于1.5mL冻存管中，液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。

注：本公司暂时不接真菌、精浆、海洋生物、水果果实

Ⅲ 避坑指南

（1）The better the sample, the better the result

（2）The worse the sample, the worse the result

（3）同组内，保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）

否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysis possible with only 1/2 biological replications?

（4）SmallRNA具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。

（5）miRNA片段很短，降解组织，石蜡组织的rRNA、mRNA等等均出现大量降解，在smallRNA建库过程中，试剂盒不区分片段类型，

长度类似的序列均会建库，故降解样本会严重挤占miRNA测序数据，要么不做，要么加测数据量。

Ⅳ 项目流程

V 部分结果展示

CircRNA-seq

Ι 背景介绍

环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。

在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（ miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。

Ⅱ 样本准备

物种	总RNA送样要求	送组织样量要求	备注
动物组织	体积≥20ul,浓度≥150ng/ul，总量≥3ug 琼脂糖凝胶电泳28S与18S清晰无降解无gDNA、蛋白等杂质污染无颜色异常避免紫外和强酸碱环境，不可反复冻融，装载于1.5mLEP管中。	组织鲜重≥800mg	手术组织生理盐水冲洗，剔除非目的组织和结缔组织，切割样本请于冰上进行，而后建议置于1.5mL冻存管中液氮速冻转-80℃/RNAlater保存
细胞		细胞总数≥1x10⁸	生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞，取下后PBS冲洗1次。而后，每1×10⁸细胞加入足量TRIzol，枪头反复吹打细胞混匀后，置于冻存管中液氮速冻，放入-80 ℃冰箱保存。 ▶不要用RNAlater保存细胞
抗凝全血		抗凝全血≥8mL (不包括trizol体积)	▶离心分离得到白细胞或者有核细胞，加TRIzol 处理，液氮速冻干冰运输 ▶冻存管中加入TRIzol和新鲜血液（TRIzol：血液=3：1）。样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解。室温孵育5min以使核蛋白体完全分解。写好编号，封口膜封存，液氮速冻，-80°C冻存。
PAXgene采血管		≥5管	送样前一定备注是PAXgene 法获取，提取方式不同

Ⅲ 避坑指南

（1） Thebetter the sample, the better the result

（2） Theworse the sample, the worse the result

（3）同组内，保证样本生物学重复≥3，建议3-5例（注意，非技术重复！）否则可能会遇到审稿人问：How was the statistical analysispossible with only 1/2 biological replications?

（4） CircRNA具有组织特异性、时空特异性。做肝取肝，做脑取脑，做细胞取同一批同一时间。

（5） LncRNA能做的是LncRNA+mRNA测序，并在由于其第一步去除rRNA的建库方式，可获取部分（10-20%）的circRNA信息。通过这种方式获取的circRNA，circRNA是可信结果，但可能从宏观看，丢失了很多circRNA关键信息。

（6）建议同一份样本做smallRNA+mRNA或者全转录组，获取更多的互作信息。

Ⅳ 项目流程

V 环状RNA有哪些生物功能

▶CircRNA顺式调控亲本基因的表达

一方面，circRNA可以与RNA结合蛋白相互结合影响亲本基因mRNA的表达。另一方面，环状RNA形成过程中内含子间竞争性互补配对可以与线性RNA之间达成一种平衡，影响mRNA的表达，其至蛋白翻译。

▶ceRNA竞争机制——circRNA海绵吸附microRNA

Nature杂志上发文报道，CDR1基因起源的环状RNA(ciRS-7)可以结合吸附miR-7，从而降低miR-7的活性，间接上调miR-7相关靶mRNA基因的表达。由于环状 RNA的稳定性，在机体内潜在对microRNA的吸附能力要强于线性的mRNA和IncRNA，所以在整体调控网络中，circRNA的竞争机制是非常特别的一种调控方式。

▶作为疾病的生物标注物?

众所周知，RNA表达具有组织特异性，环状RNA亦然。研究发现has circ 002059在冒癌中表达下调，是一个潜在的胃癌诊断的biomarker。某专家团队对肝癌细胞外泌体circRNA测序发现，circRNA在外泌体中大量富集目于正常细胞相比差异很大，同时血清中肿瘤circRNAs的富集程度甚至与肿瘤的大小有关。

VI CircRNA研究思路