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16S/18S/ITS菌群测序

宏基因组

宏转录组

细菌/真菌重测序

细菌完成图

微生物多样性扩增子测序

Ι 背景介绍

扩增子测序——是使用细菌、真核生物、真菌通用引物，分别扩增研究环境下微生物群体的16S rDNA/18SrDNA /ITS高变区或功能基因，通过高通量测序获得巨量扩增产物序列信息，并通过生物信息学算法与统计学，搜集变异信息、物种组成丰度信息，分析特定环境下的微生物群落的多样性和分布规律，以揭示环境样品中微生物的种类、相对丰度、进化关系等。

Ⅱ 样本要求

注：1、不接收培养平皿、培养试管、和大管纯菌液样本，易造成环境污染；

2、不接收0.2/0.6mLPCR管装载的原始样本/核酸样本。易丢失、开管、样本标记不清晰等；

3、若送DNA样本，请保证体积＞25ul。质检需要消耗，扩增片段消耗，可能出现不够的情况。

Ⅲ 扩增区段选择

【细菌】——16S测序

细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5SrRNA（120bp）、16S rRNA（约1540bp）和23S rRNA（约2900bp）。5S rRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23S rRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16SrRNA普遍存在于原核细胞中，具有含量高、拷贝数多特点（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析标准。

16S rRNA编码基因序列共有10个保守区和V1-V9共9个高变区。V3-V4区变异区长，数据库信息全，是二代细菌多样性分析注释的最佳选择。多样性的组成核心在于SNP多样性，

16S标准引物推荐——参考文献：DOI: 10.1371/journal.pone.0006669

上游引物名称338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA

下游引物名称806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT

三代16S将检测V1-V9区域测通。

【真核生物】——18S测序

真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28SrRNA。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，具有保守区与可变区（V1-V9，没有V6区）。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种级及以上的分类标准。其中，V4区使用频次最多、数据库信息最全、分类效果最好，是真核18S测序分析注释的最佳选择扩增区段。

【真菌】——ITS测序

ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析

Ⅳ避坑指南

（1）16S选择的测序区域各不相同（如V4，V3-V4，V1-V3，V3等），选择的依据是什么，选择哪个区域比较好？

首先确认一点：不同物种、不同V区，多样性不同，选择不同区域测序结果会有不同，可能会造成物种多样性的低估或高估。在非全长16S（三代测序V1-V9测通）测序的情况下，测序区域也并非越长越好，跟全长16S结果最相近的测序区域即是最优选择。如无特殊要求，我们一般推荐V3-V4区测序，根据项目经验，目前测序项目较多的区域为V4（通用）, V1-V3（皮肤与生殖道） V3-V4（通用）, V4-V5（通用），具体区域也可参考相关文献进行选择。

（2）扩增子测序能满足的测序长度是多少？

Illumina公司有2款扩增子常用测序仪，Novaseq6000与Miseq。MiseqPE300（Pair end 300bp）模式测序长度为600bp，但Miseq老平台测序质量较差，仅质控就要过滤掉100bp+低质量序列，实际可用数据有限；Novaseq6000测序仪PE250（Pairend 250bp）模式测序质量较好，但测序总长度为500bp，去掉barcode、index和前几个低质量碱基，约剩余480bp左右可用数据。所以保守起见，扩增子片段长度不要超过480bp，否则影响序列拼接。

（3）16S测序一般准备多少样本个数？

关于微生物扩增子测序，不论16S还是其他，样本多样性、组间差异分析等等，均是基于生物统计学范畴进行的分析，组内/整体样本数越多，统计结果越准。检测下限：样本间多样性分析（n≥4），组间多样性分析样本（组别≥2，每组样本数n≥3）。

如果同计划做代谢组，由于质谱本身的技术差异，一般一组内样本数量（n≥30），除样本极其难得情况可酌情减量外，组内低于30例样本不建议做。

（4）研究环境中真核微生物多样性，18S测序和ITS测序哪个更好?

18S测序针对的是真核微生物，注释到的范围广，但是就真菌来说精确度相对较低；ITS测序主要是针对真菌多样性的研究，注释准确度高；可根据研究目的合理选择测序方案。

V 项目流程

二+三代16S测序分析流程图.png

VΙ 部分结果展示

宏基因组测序

Ι 背景介绍

自然界的微生物物种至少达到百万数量级，然而目前发现的只有数万种，绝大多数的微生物物种都无法在实验室条件下通过培养分离获得。

因而，尽管微生物蕴藏着极为丰富的物种资源和基因资源，但它们在生理生化、代谢活性和行为功能等多方面的特性还有待更深层次的挖掘，

人类对于它们的认知也将随之不断刷新。借助NGS技术 (Next Generation Sequencing，NGS) ，我们可以对微生物基因组的特定区域进行扩增子测序 (Amplicon sequencing)，普查群落的具体组成结构，掌握其多样性变化规律，并揭示其中的优势物种；在此基础上，还可以进一步开展宏基因组(Metagenome)、宏转录组 (Metatranscriptome)和宏病毒组 (Virome)研究，通过鸟枪法测序技术 (Shotgun sequencing)，结合全微生物组关联分析 (Microbiome-Wide Association Studies，MWAS)的策略，分别从 DNA 和 RNA 水平，更全面精细地展示整个群落的功能代谢谱和表达谱(宏病毒组可以针对DNA病毒和RNA病毒分别进行测序研究，此时，将只关注群落中各类病毒的组成、功能和相互作用)，进而从原理上阐明微生物群落在生态系统中发挥作用的根本机制。

Ⅱ 样本要求

注：

1、不接收原始的——培养平皿、培养试管、和大管纯菌液样本，易造成样本与实验环境污染；

2、不接收小PCR管装载的原始/核酸样本。易丢失、裂管、标记不清晰等，建议1.5mL/2.0mL EP管装载；

3、若送DNA样本，请保证体积＞25ul。质检需要消耗，扩增片段消耗，可能出现不够的情况

Ⅲ 技术特点

可以直接获得微生物功能基因的相对丰度
基于已知物种, 鉴定分辨率可达物种、甚至菌株水平
不需要微生物群落相关的先验知识 (如捕获噬菌体、病毒、质粒以及微小真核生物等)
基本不会产生PCR偏好性
可以估算有参考基因组微生物的原位生长速率
可组装获得群体平均基因组 (甚至可以获得其中一些微生物较完整的基因组)
可以挖掘新的基因家族。

IV应用场景

医学领域：常见疾病与人体微生物的关系研究，肠X轴、感染领域等
动物领域：牲畜肠道、瘤胃(如产甲烷菌类群)与动物健康、营养消化研究等
农业领域：根际微生物与植物互作、农业耕作、施肥处理、菌剂开发、土壤微生物群落研究等
环境领域：雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境研究等
特殊极端环境：极端环境条件下的微生物类群研究

【避坑指南】

（1）关于宏基因组测序数据量选取。多少才够？当销售员推荐6G就行，我该怎么选？

【Tip 1】：宏基因组测序不区分DNA来源，来自宿主和细胞器DNA污染可能会掩盖微生物的特征。

不论是宿主还是微生物，都会被测出。若送测样本为【宿主组织+待测样本】情况，如【肠粘膜、肿瘤组织、整段肠道+内容物】，通常需要提高测序数据量到10G左右，甚至更高，以保证数据下机后，从数据端剔除宿主序列，获取可用微生物数据进行后续分析。

【Tip 2】看样本复杂程度

所谓样本复杂程度，就是样本本身DNA的多样性初步判断。举例：比如人类肠道取得粪便样本，属于厌氧环境，虽然人类宿主DNA+细菌DNA+真菌DNA+病毒DNA+部分真核生物DNA等种类较多，大类相对简单，常规6G足够。如果是环境类样本，其中的微生物同时存在厌氧型、共生型、腐生型、兼性厌氧型等等，功能复杂，这种一般需要测10-15G，甚至更高。

【Tip 3】是否进行Contig Binning分析

简单说就是把宏基因组数据中来自同一菌株的序列聚到一起，得到一个菌株的基因组。根据基于聚类的序列类型的不同，分为reads binning，contig binning 和 genes binning。近年来高分文章中多使用Contig Binning，即将组成相似或丰度一致的Contigs聚类到同一物种从而完成单菌的草图组装，进一步解析菌株的功能特性。