10X genomics转录组 10X ATAC 10X 空间转录组 CITE-seq SMART-seq 单细胞基因组-MALBAC |
10X Genomics 单细胞（核）转录组测序
Ι 背景介绍
10X Genomics 作为单细胞转录组测序技术主流平台之一，能实现大规模的单细胞转录组测序，具有细胞通量高、细胞捕获率高、项目周期短等优点，并广泛应用于细胞异质性、免疫细胞群体检测及构建细胞图谱等研究。
Ⅱ 样本要求
注：
1、确定合同，提前申请寄送给客户组织保存液；客户收到组织保存液后请立刻放在4°C保存
2、客户将新鲜组织样本处理成适宜体积后（一般为小黄豆大小，以充分浸泡），直接放入装有组织保存液的储存管中。；
3、组织尽量无菌放入液体中，迅速盖紧加封口膜包装好。客户需标明：样本名称，组织类型，离体时间， 浸入组织保存液时间。
4、样本要求：大于 0.2g 实体瘤组织，保护液能完全浸没组织为宜，如样本量足够建议首 次寄送同一样本 2-3 管重复，以作备用。
5、冰袋寄送(注意不要选择干冰)，装有样本的储存管不能和冰袋直接接触，需用泡沫纸包裹；固定储存管，避免运输晃动对样本产生影响
6、上海、重庆、广州设有服务实验室，请务必保证在 48 小时内到达实验室，血液样本需4小时内送达实验室；
消化合格单细胞悬液质控信息如下：
Ⅲ 单细胞捕获过程（基于油包水原理的10X genomics公司示例）
IV 单细胞测序分析内容与各项流程标准
附件壹、单细胞测序分析内容
分析类型 | 单细胞转录组数据分析条目 | 分析注释 | 分析范畴 |
单细胞转录组标准分析模块 | 原始数据整理与质控 | 标准分析 | |
比对结果统计 | 标准分析 | ||
细胞定量分析 | 基于 Cell Ranger 生成的 knee plot，可直观的看出 Cellranger 对于是否为细胞判定标准。 | 标准分析 | |
Cellranger分析 | 标准分析 | ||
多样本数据整合分析 | Satija最新的单细胞测序数据整合算法。该新算法综合了基于 CCA 降维和 MNN 搜索互近邻的方案，具有更高稳健性和整合准确率 | 标准分析 | |
Seurat细胞分群 | ①使用 Normalization函数 LogNormalize 方法，进行表达量标准化。②PCA降维分析；③louvain /leiden 算法对归一化后的数据进行聚类，识别细胞群；④分群结果可视化使用UMAP与TSNE两种方法 | 标准分析 | |
UMAP 降维分群 | 标准分析 | ||
TSNE降维分群 | 标准分析 | ||
Marker基因分析与亚群间 Marker 基因挖掘与可视化 | 基于 wilcox 算法，分析 cluster 内的细胞和其他 cluster 中 | 标准分析 | |
Marker基因GO富集分析 | 使用 clusterProfiler 进行 GO 富集分析，分析时利用 GO term 注释的 marker基因对每个 term 的基因列表和基因数目进行计算 | 标准分析 | |
Marker基因KEGG pathway功能分析 | 标准分析 | ||
Marker 基因 Reactome 富集分析 | 标准分析 | ||
样本间比较分析 | 细胞群内差异分析,对同一个cluster 内属于不同样品的细胞进行两两比较差异分析。以 | 标准分析 | |
各亚群样本间差异基因GO富集分析 | 同亚群间差异分析，使用 clusterProfiler 进行 GO 富集分析， 使用 Seurat 的FindMarkers 模块计算出组间差异基因， 然后通过超几何分布方法计算 P value（显著富集的标准为 P value < 0.05 ），找出与整个基因组背景相比，差异基因显著富集的 GO term | 标准分析 | |
各亚群样本间差异基因KEGG富集分析 | 标准分析 | ||
SingleR细胞亚型鉴定 | 标准分析 | ||
Monocle2拟时序分析 | 分析来进行细胞亚群进化关系的构建对于研究细胞的分化 | 标准分析 | |
单细胞细胞周期分析 | 标准分析 | ||
单细胞细胞通讯分析 | 使用CellChat进行分析。通过使用网络分析以及配对模式来识别细胞间主要的输入与输出 | 标准分析 |
个性化模块 | inferCNV分析 | 基于单细胞转录组数据进行拷贝数变异（copy number vatiants,CNV)分析 | 个性化 |
肿瘤进化 | 基于inferCNV结果构建肿瘤进化树 | 个性化 | |
RNA速率分析 | 通过区分剪切与非剪切mRNA计算RNA速率来推论进化轨迹 | 个性化 | |
细胞再分亚群 | 筛选某类细胞后进一步细分亚群，基于barcode挑选出来的细胞亚群，重新PCA进行细胞分群 | 个性化 | |
配体受体分析-细胞通讯分析 | 基于数据库采用均值乘积计算分析配体-受体相互作用 | 个性化 | |
GSEA/GSVA富集分析 | 采用GSVA或者GSEA工具进行两个比较组合之间（例如，不同细胞类型，同一细胞类型不同个体）的富集分析 | 个性化 | |
WGCNA | 加权基因共表达网络分析，查找协同表达的基因模块，推测网络中的核心基因。 | 个性化 | |
差异富集分析（个性化组合） | 不同样本或细胞亚群之间的GO/KEGG/Reactome富集分析 | 个性化 | |
SCENIC分析 | 1基因调控网络 | 个性化 | |
（1）推断转录因子与潜在靶基因之间的共表达模块； | 个性化 | ||
（2）基于DNA-motif分析潜在的直接相关的靶基因。 | 个性化 | ||
2细胞活性聚类 | 个性化 | ||
（1) 构建细胞每个转录因子共调节模块（AUC）; | 个性化 | ||
（2) 确定每个转录因子活性AUC阈值,将细胞分为某种调节子的on或者off两种状态，然后进行后续的细胞聚类分析。 | 个性化 | ||
基因集分析 | 针对甲方给定的genelist，在不同细胞类群内进行case和control的比较 | 个性化 | |
基因表达展示 | 提供散点图、小提琴图、热图和气泡图四种图 | 个性化 |
按分析样本数量（数据量）、分析次数、人时、机时收费
单细胞测序注意项
一、基本信息
1、物种：人/小鼠/其他（植物暂时不接）；
2、组织类型：新鲜取得组织/冻存组织；
3、样本个数：X个；
4、单细胞捕获平台：10X Genomics 3’转录组测序V3版试剂套装/5’V2版试剂套装；
5、测序平台：进口illumina Novaseq；
6、测序数据量：100Gb/样本
二、数据分析与售后服务标准
1、数据分析：提供每个样本的原始数据与初步分析cellranger与矩阵，标准数据分析一套，见模板报告；默认保存数据为6个月，6个月后自动删除；
2、定义细胞群，最好由客户提供Marker genes。若不能，我们将按照我们的marker库进行细胞定义，若用我公司marker库分析后认为还需要自己调整marker注释，我们将按数据量与计算量评估收费；
3、单细胞测序标准分析交付后。后续分析皆为个性化数据分析，根据难易程度评估收费。
三、收费标准：
1、运输费用：我方承担；
2、单细胞组织保存液：我方承担；
3、单细胞组织解离：解离若成功后续不进行实验则收取成本费500元；若失败一次补充送样后成功进行后续实验，不收费。若失败后不再进行此样本的后续实验，收取解离试剂及人工成本费500元；
4、从原始样本到初步分析cellranger与矩阵文件：议价
5、标准数据分析一次：议价。
6、标准分析后需要其他分析，评估收费。
四、风险样本情况风险解读：若客户确认风险，样本出现下列问题，客户需承担正常费用。
1、组织解离后，单细胞活性＜80%，组织状态不佳，不建议上机。若客户风险上机，风险为：基因表达中位数低，细胞捕获的数量可能不稳定（如计划捕获8000个，可能会出现捕获4000个或者13000个这种状况）；
2、解离后单细胞悬液总细胞数量＜4万个，风险样本。细胞捕获的数量可能不稳定（如计划捕获8000个，可能会出现捕获4000个或者13000个这种状况）
3、解离后碎片量占比＞20%，风险样本。单细胞捕获仪在捕获过程中是根据细胞直径、流速综合进行捕获，不会区分是细胞/碎片。如：目标捕获10000个细胞，碎片占比20%，最终可能捕获到8000左右的细胞数，或者更低，或者更高。
10X Genomics单细胞ATAC测序
Ι 背景介绍
10X Genomics单细胞ATAC测序可进行单细胞水平的染色质易开放区域测序，展示表观遗传学⽅⾯的变化，并深入了解基因调控机制。
染色质可及性（chromatin accessibility）：DNA与组蛋白结合形成核小体，核小体进一步折叠压缩后形成染色质，DNA的复制和转录都需要将染色质紧密结构打开，允许调控因子结合DNA，这部分打开的区域，称之为开放染色质（accessible-chromatin）；开放染色质区域允许调控因子结合的特性，称之为染色质可及性。通过研究细胞特定状态下开放的染色质区域可以在DNA水平上了解其转录调控。
Ⅱ 实验原理与流程
单细胞ATAC原理：组织/细胞抽核处理后，使用Tn5转座酶酶切细胞核内染色质开放区域，同时插入测序接头，然后利用10X Genomics微流控技术，将细胞核包裹到油滴中生成乳浊液（GEMs），所有来自同一个细胞核的DNA片段的10x barcode相同，破油后，形成样本混合液，用于下游处理和文库制备。
细胞核裂解 → 转座酶&细胞核共孵育 → 细胞核Barcode标记 → 文库构建 → 上机测序 → 数据分析 → 结束
【避坑指南】
1.10X Genomics ATAC样本要求与细胞核质控标准
1）物种：人、小鼠；
2）细胞类型要求：能够制备成高质量单细胞核悬液的类型；
3）细胞核抽提质量要求：活细胞比例<5%；显微镜下，细胞核形态完整；尽量去除细胞碎片和细胞团，细胞核总量≥10w。使用10X Genomics公司试剂盒进行10X ATAC 抽核。
2.染色后的切片抽核是否可进行10X ATAC？
NO！染料会结合DNA部分区域，影响核内DNA构象，这种情况做10X ATAC数据不准确。
3.如何将10X ATAC和10X 转录组数据联合使用？
①【推荐】10X ATAC+10X 转录组：组织分为两份，一份悬液做10X RNA-seq，另一份直接抽核做10X ATAC-seq。分开分别做单细胞转录组和ATAC。生信分析通过Find Transfer Anchors鉴定scATAC-seq数据集和scRNA-seq数据集的锚点进行整合分析。
② （不建议，不成熟）10x Chromium Single Cell Multiome：基于同一细胞核的单细胞3’基因表达和开放染色质分析，可以同时检测同一细胞核的可及性区域数据和转录本数据，实现单细胞的多组学联合分析。
4.单细胞ATAC测序，是否必须进行核悬液制备？
需要，转座反应需要细胞核分离才能有效工作。如果没有细胞核分离，转座试剂和酶就无法进入核DNA，检测性能将受到严重影响。
10X Genomics 单细胞空间转录组测序
背景介绍
空间转录组完美结合组织形态观察优势和转录组学高通量测序优势， 完成对一张组织切片近5000个spot点的高通量测序。10 x Genomics Visium空间转录组技术借助高通量测序数据和组织原位barcode标记构建空间表达图谱，提示不同组织位置的异质性，实现了从基因表达到组织空间区域对生命表型特征的全面解析，为组织微环境、细胞间信号通路和空间异质性研究提供了全新的解决方案，被广泛应用于人源及动植物的研究中。10 x Visium CytAssist无需透化优化/ 贴片测试等实验环节，大大缩短项目周期，节约样本使用量，一个基因设计多对探针，检测灵敏度提高，基因检出率更高，拥有更好的样本兼容性。
空间转录组可接类型【OCT包埋/FFPE样本/新鲜组织】
一、OCT包埋组织空间转录组流程
1、OCT包埋的组织处理
新鲜组织样本取下后，应立即用预冷的PBS溶液或生理盐水冲洗表面残留物，然后用吸水纸吸干液体。这一步非常关键，因为如果组织表面有液体残留，OCT包埋后可能会形成冰晶，影响切片效果。
2、低温处理
整个样本处理过程应在低温环境下进行，以保持组织的活性。
OCT包埋步骤详解
①、将OCT置于冰上或4度冰箱预冷10分钟以上，并在包埋模具上做标记，确认组织方向。
②、在包埋槽中加入1/3或更多的预冷OCT。
③、用吸水纸吸去组织表面的血液或组织液，但要保持组织湿润。
④、将组织放入含有OCT的包埋槽中。
⑤、加满预冷的OCT，确保组织被完全包埋。
⑥、确认组织周围没有气泡，将包埋槽置于干冰上，直至OCT完全冻结。这一步要确保最终组织周围无气泡产生，因为气泡会在OCT冷却后在组织周围形成空洞，影响切片效果。
⑦、2分钟后再次添加预冷OCT至完全覆盖组织。
⑧待组织块变白后，包埋完成，可长期保存（3个月）。用足够量的干冰运送。
二、石蜡切片空间转录组流程
石蜡包埋流程与建议：
石蜡样本RNA质量评估样本方法
IV 空间转录组各版本比较一览表
CITE-seq！同时获得单细胞转录组+膜蛋白数据-基于10X Genomics单细胞捕获系统
CITE-seq技术背景与原理
CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing）将单细胞转录组测序与细胞表面蛋白检测相结合的一项技术方法。具体来说，它通过将带有寡核苷酸标签的抗体（oligo-conjugated antibodies）与细胞表面蛋白结合，然后在单细胞测序过程中同时捕获RNA和抗体标签。
传统的单细胞RNA测序（scRNA-seq）主要关注细胞内的基因表达，但无法直接提供细胞表面蛋白的信息。但是，细胞表面蛋白在细胞识别、信号传导和免疫反应中起着关键作用。因此，单细胞CITE-seq技术应运而生。
这种技术利用了10× Genomics的Feature Barcode技术，能够在单细胞水平上同时检测多达数百种细胞表面蛋白。
二、技术优势
高通量与高灵敏度CITE-seq可以一次检测100个以上的表面蛋白，且抗体数量不受限制。与传统的流式细胞术相比，CITE-seq能够更清晰地鉴别细胞类型，甚至可以注释到罕见细胞类型和发现新的细胞亚群。
三、技术流程
CITE-seq的实验流程主要包括以下几个步骤：
1、细胞准备从组织中分离出单细胞悬液，并确保细胞的活性和完整性。
2、抗体标记使用带有寡核苷酸标签的抗体对细胞表面蛋白进行标记。这些抗体通过特异性结合细胞表面蛋白，将寡核苷酸标签固定在细胞表面。
3、单细胞捕获与测序利用微流控技术将单个细胞与GEM（Gel Bead-in-Emulsion）结合，形成单细胞的转录组和蛋白质组的测序文库。
4、数据分析使用Cell Ranger等软件处理测序数据，并通过Loupe Browser等工具进行可视化分析。数据分析的重点在于解析细胞类型的异质性、细胞状态的变化以及细胞表面蛋白的表达模式。
四、应用领域
免疫细胞研究
CITE-seq技术在免疫细胞的表型分析中具有重要应用。例如，通过分析T细胞的表面蛋白和转录组信息，可以将T细胞进一步划分为初始、记忆和耗竭的亚群。这种精细的免疫细胞分型有助于深入理解免疫反应的机制。
癌症研究
在癌症研究中，CITE-seq技术被广泛应用于分析肿瘤微环境的异质性。例如，通过分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤组织，研究人员可以确定不同免疫细胞亚群的转录状态和表面蛋白表达模式。此外，CITE-seq技术还被用于研究癌症免疫逃逸机制，例如通过解析免疫检查点抑制剂耐药性的分子机制。
组织发育与疾病模型
CITE-seq技术还可以用于研究组织发育和疾病模型中的细胞异质性。例如，在肝脏研究中，CITE-seq技术被用于绘制人类和小鼠肝脏的单细胞空间蛋白质基因组图谱，揭示了脂质相关巨噬细胞群体的特征。
五、相关研究
1、2021年发表在《Cancer Cell》的非小细胞肺癌（NSCLC）文章：
在这项研究中，研究人员未经治疗的8名早期非小细胞肺癌（NSCLC）患者，使用包括CITE-seq、scRNA-seq以及TCR-seq。通过整合免疫细胞表面标记的抗体分析，作者们构建了三个独立的数据库。
其中CITE-seq部分，开始使用了15种抗体用于细胞类型的初步注释，并在后续研究中增加至81种抗体，以实现更精细的细胞亚群分类。
该研究通过对35个NSCLC病人中相匹配的肺部肿瘤与非肺部组织的scRNA-seq、CITE-seq以及TCR-seq，构建了迄今为止最大的早期肺癌免疫反应细胞图谱，并通过对其中免疫细胞类型的分析建立了对NSCLC肿瘤进行详细分型的LCAM模块，LCAM评分较高说明患者正在经历一个更有力的抗原特异性抗肿瘤适应性免疫应答过程，同时说明LCAM可以作为更直接的衡量抗原特异性抗肿瘤免疫激活的指标。
文献链接：Single-cell analysis of human non-small cell lung cancer lesions refines tumor classification and patient stratification - PMC
2、2021年发表在《Nat Genet》文章
该研究基于CITE-seq技术开发了Perturb-CITE-sequencing（Perturb-CITE-seq），通过单细胞转录组和蛋白质测序实现了对CRISPR-Cas9编辑信息的精准读取。在患者来源的黑色素瘤细胞与自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共培养体系中，研究人员在约750种与癌细胞内在免疫检查点抑制剂（ICI）耐药相关的扰动条件下，分析了约218,000个细胞的转录组和20种蛋白质的表达情况。
借助单细胞测序技术，研究不仅揭示了已知的耐药机制，例如干扰素-γ（IFN-γ）-JAK/STAT信号通路的缺陷以及抗原呈递途径的异常，还发现了新的耐药机制，包括CD58的丢失或下调。这些发现为深入理解肿瘤耐药机制提供了新的视角，并为开发更有效的免疫治疗策略奠定了基础。
文献链接：Multimodal pooled Perturb-CITE-seq screens in patient models define mechanisms of cancer immune evasion - PubMed
①蛋白种类多：CITE-seq可以一次检测100个以上的表面蛋白；抗体数不受限制。
②更清晰的鉴别细胞类型，可以注释到罕见细胞类型，发现新细胞亚群
③结合cell Hashing标签技术，可以有效改善dropout问题
④转录表达谱+蛋白：实现同一个细胞多组学联合检测，同时提供了mRNA和细胞表面蛋白的信息，单细胞数据更丰富
抗体搭配类型：
10X genomics 3'转录组+TotalSeqA/TotalSeqB系列抗体
10X genomics 5'转录组+TCR+BCR+TotalSeq C系列抗体
10X genomics 空间转录组+TotalSeq Bn系列抗体
SMART-seq2微量样品转录组测序
服务内容与技术流程：
技术参数：
| 所需样本要求 | 1-1000个细胞 | 推荐测序数据量* | 3-8G/sample |
| 10pg-10ng total RNA | 项目周期 | 35天 | |
| 分析内容 | 1.对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量 reads 的处理； 2、数据产出统计及测序数据的成分和质量评估； 3、参考基因组mapping，默认使用GRCh37为参考序列，基因组结构注释文件和功能注释文件默认使用常用GTF文件； 4、基因表达水平分析： 4.1 基因表达定量分析； 4.2 样本间PCA分析（≥4个样本） 5、差异表达分析及功能注释（≥2个样本） 6、富集分析 6.1 差异表达基因的GO生物学功能富集分析； 6.2 差异表达基因的KEGG信号通路富集分析； 6.3 差异表达基因的reactome富集分析 7、可变剪切分析与可变剪切事件筛选 8、SNP、InDel分析统计 9、融合基因分析（非标准分析项） | ||
*测序费用与测序数据量相关
优势与应用：
1、解决微量样品转录组测序建库量不够的难题，如流式下来的微量细胞群、穿刺样本、生殖医学研究、激光显微切割单细胞样本等。实现10pg-10ng级RNA的高通量测序；
2、SMART-seq2测序覆盖mRNA全长信息，相比10X Genomics类高通量单细胞捕获系统只检测mRNA 3’末端的~90bp的区域，检出基因数更高、基因结构变化信息更丰富，细胞进行分群更精准；得益于此，它还可以用于分析可变剪接、RNA层面的SNP/InDel、融合基因等信息。
3、SMART-seq2属于低通量转录组，结果可靠，可用于10XGenomics、BD等高通单细胞测序后，具体某类细胞群功能深度探究工作。
部分结果展示：
重测序
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